BIOLOGI SEL MOLEKULER, MERANCANG PROBE

LAPORAN RESMI BIOLOGI SEL MOLEKULER
P-1
MERANCANG PROBE

A.      TUJUAN

1.       Merancang dan menganalisis probe yang akan digunakan dalam Southern Blot dengan menggunakan Bioinformatics data base (NCBI)

2.       Mengetahui dan memahami cara mendeteksi terjadinya ekspresi gen dengan teknik hibridisasi metode Southern Blot.

B.      DASAR TEORI

Gen adalah suatu unit pewarisan sifat bagi organisme hidup. Tiap organisme memiliki gen yang merupakan sekuen DNA yang menyandi kode genetik yang dapat diekspresikan menjadi protein. Gen tidak sesalu diekspresikan tergantung pada pengaturan nomeostatis yang terjadi pada tiap organisme. Batasan modern gen adalah suatu lokasi tertentu pada genom yang berhubungan dengan pewarisan sifat dan dapat dihubungkan dengan fungsi sebagai regulator (pengendali), sasaran (transkripsi), dan peran-peran fungsional lainnya.

Probe adalah untai tunggal yang dapat membentuk pasangan dengan urutan komplementer pada polinukleotida untai tunggal lain yang tersusun dari DNA atau RNA. Proses ini dikenal sebagai penyatuan kembali (reannealing) atau hibridasi. Untuk mengidentifikasi urutan sasaran probe harus membawa suatu label.

Probe dapat terdiri dari cDNA (dihasilkan dari mRNA oleh reverse transcriptase), fragmen DNA genom (diputuskan dari genom oleh enzim restriksi), oligonukleotida yang disintesis secara kimiawi atau kadang-kadang RNA. Terdapat sejumlah teknik untuk memasukkan label ke dalam probe tersebut. Tidak semua probe diberi label radioaktif. Sebagian adalah produk kimia tambahan (senyawa yang berikatan secara kovalen dengan DNA) yang dapat diidentifikasi, misalnya dengan fluoresens.

DNA probe adalah suatu fragmen DNA atau RNA atau protein pelacak target gen. DNA probe yang telah dilabel akan berkomplementasi dengan target melalui hibridisasi sehingga dapat mendeteksi keberadaan gen dilacak sehingga ikatan komplemen probe dengan DNA target cenderung lebih kuat dan presisi. Sedangkan heterologus adalah probe diperoleh dari sumber organisme yang berbeda atau dibuat secara sintetik sehingga ikatannya kurang presisi dengan gen target.

Hibridisasi DNA target dengan probe dapat dideteksi dengan cara menguji kehadiran gugus reporter probe. Jika reporter terdeteksi, maka telah terjadi hibridisasi. Namun jika reporter tidak terditeksi, maka dapat disimpulkan bahwa molekul DNA target tidak mempunyai sekuens yang komplementer dengan sekuens probe. Karenanya gen atau segmen DNA yang dicari tersebut tidak terdapat pada sampel.

Hibridisasi merupakan pembentukan ikatan dupleks stabil antara dua rangkaian nukleotida yang saling komplementer melalui perpasangan basa N. Mekanisme dasar di balik uji-uji diagnostik yang menggunakan probe asam nukleat adalah hibridisasi. Hibridisasi bisa terjadi antara :

1.  DNA target dengan pelacak cDNA/mRNA (disebut Southern Blot Technique)

2. RNA target dengan pelacak RNA/DNA (disebut Nouthern Blot Technique)

3. Protein target dengan pelacak Antibodi (disebut Westhern Blot Technique)

Metode hibridisasi ini merupakan metode yang sangat peka untuk menganalisis maupun menentukan karakter suatu fragmen DNA. Metode ini dapat diterapkan pada beberapa keperluan mulai dari mencari informasi letak suatu fragmen DNA dengan Genom, analisis transkripsi dan regulasinya, deteksi penyakit genetik serta sidik jari DNA.

Metode hibridisasi meliputi dua proses, yaitu : proses denaturasi atau pemisahan dua rantai asam nukleat yang komplementer dari proses renaturasi atau perpaduan kembali dua rantai asam nukleat. Proses denaturasi biasanya dilakukan dengan cara pemanasan DNA untuk memecah ikatan hidrogen yang terdapat diantara pasangan basa sehingga rantai asam nukleat akan terpisah. Proses ini kemudian diikuti dengan proses renaturasi dengan cara pendinginan.

Keadaan denaturasi besar manfaatnya dalam penukaran DNA. Ketika dalam utas tunggal itu suatu fragmen DNA bisa dihibrid dengan fragmen DNA lain. Misalnya dihibrid dengan penjejak suatu kelainan atau penyakit atau probe. Probe adalah potongan pendek DNA double helix juga. Kalau dalam suatu media terdapat DNA sampel bersama probe, lalu didenaturasi, maka kedua utas DNA masing-masing akan lepas, sebagian kembali berpasangan sendiri-sendiri dengan pasangan masing-masing,sebagian lagi terjadi hibrid antara fragmen DNA sampel dengan probe. Probe terdiri dari belasan bp saja, dan fosfatnya diberi penanda unsur P radioaktif yang bersetengah umur pendek, sehingga tidak berbahaya bagi pengamat atau petugas medis. Probe dibuat sedemikian rupa sehingga ia memiliki urutan yang komplemen dengan suatu fragmen restriksi DNA sampel. Fragmen restriksi ialah potongan-potongan DNA yang telah dipotong oleh enzim restriksi. Hampir seratus macam enzim restriksi, masing-masing memotong di antara dua basa tertentu.

Probe hibridisasi asam nukleat harus memiliki spesifitas yang sangat tinggi. Dengan kata lain, probe harus hibridisasi secara eksklusif pada sekuens asam nukleat target yang dipilih. Positif palsu (i.e., respon pada ketidak hadiran sekuens target) dan negatif palsu mengganggu kegunaan dari prosedur diagnostik. Probe dapat menjadi spesifik pada berbagai tingkat organismik. Mereka dapat membedakan antara dua atau lebih spesies, menentukan srain tertentu dalam suatu spesies, atau mengidentifikasi perbedaan antara gen. Bergantung pada keperluan protokol test, probe bisa DNA atau RNA; panjangb (>100 nukleotida) atau pendek (<50 nukleotida); disintesa secara kimia, mengklon gen yang utuh, atau mengisolasi daerah tertentu dari gen.

Ada beberapa macam hibridisasi, yakni :

1.      Southern Blots

Southern blots digunakan penemuan gen dan pemetaan, evolusi dan studi pengembangan, forensik dan diagnostik. Dalam tingkat genetik untuk memodifikasi pada organisme, Southern blot digunakan sebagai test untuk memastikan bahwa bagian DNA tertentu mengenal urutan gen. Southern blot analysis untuk menandai karakter transforman. Southern blot analysis bermanfaat untuk mengidentifikasi bentuk berbeda, menentukan memasukkan atau menyisipkan jumlah copy dan untuk mendeteksi gross DNA penyusunan kembali yang mungkin telah terjadi perubahan. Jika kamu sedang menganalisis ß – galactosidase dengan memasukkan atau menyisipkan dan dipotong – potong dengan EcoRV maka akan dihasilakn potongan sekitar 1kb dari atas dan bawah dari urutan ß – galactosidase persandian dimulai. Pemecahan oleh enzim restriksi, Analisis Gel, dan bloting.

Southern blot adalah suatu teknik yang dikembangkan oleh Edwin. M. Southern pada 1975, seorang ahli biologi asal Inggris. Teknik ini digunakan untuk pendeteksian suatu DNA sequence spesifik (gen atau lain) dalam sample kompleks DNA (selular DNA). Ini juga digunakan untuk menentukan bobot molekular suatu restriksi fragmen dan untuk mengukur sejumlah relatif dalam sample berbeda. Di bawah kondisi-kondisi optimal, Southern blot mendeteksi ~ 0.1 pg DNA yang menarik. Blot teknik digunakan untuk memindahkan protein DNA dan RNA ke suatu pengangkut sehingga dapat dipisahkan, dan sering juga diikuti penggunaan suatu gel ectrophoresis. Southern blot digunakan untuk memindahkan DNA. Digunakan biologi molekular untuk melihat kemungkinan kehadiran suatu urutan DNA dalam suatu sample DNA. Southern blot Selatan berkombinasi gel agarose electrophoresis untuk separasi ukuran DNA dengan metoda untuk memindahkan DNA ke suatu membran filter untuk pemeriksaan hybridisasi. Metoda lain adalah Western blot dan Northern blot memiliki prinsip kerja yang sama tetapi menggunakan RNA dan protein.

2.      Northern Blot

Teknik ini pada dasarnya hibridisasi asam nukleat, perbedaannya pada RNA sebagai target. Probe sama dengan southern blot dengan target adalah mRNA. Didalam eukariot pemilihan mRNA lebih efisien karena genomic DNA tidak mempunyai intron yang mungkin interference yang mengikat probe untuk mengoreksi sekuen.

Dasarnya, teknik ini menggunakan mRNA sehingga pada agarose gel tidak menggunakan perlakuan denaturasi dengan asam kuat. Tahapan yang digunakan dalam metode ini yaitu: pemisahan mRNA dengan elektroforesis, dipindahkan kedalam membrane nylon dan diinkubasi dengan probe yang utas tunggal. Probe yang sebelumnya dilabel dengan biotin atau digoxigenin atau radioaktif. Membran kemudian diperlihatkan difilem atau substrad kromegenic. Variasi dari hibridisasi nortnblot adalah dengan teknik blot titik dimana sampel tidak diseparasi berdasarkan ukuran. Melalui teknik ini mudah dilakukan hanya dengan membrane ditetesi dengn mRNA dan probe.

Sepertihalnya sourthern blot DNA harus dibuat utas tuggal sebelum dblot. Sebelum ditetesi dengan DNA sampel maka probe terlebih dahulu untuk menghibridisasi probe. Kemudian membrane difisualisasikan di filem. Jika probe dan DNA atau RNA target mirip maka filem akan berwarna hitam. Dot blot sangat mudah dan cepat untuk menentukan sampel target yang berhubungan dengan sekuen sebelum dilakukan percobaan sesungguhnya.

3.      Hibridisasi Westhern ( Protein target dengan pelacak antibodi ).

Hibridisasi merupakan salah satu cara pengidentifikasian dengan menggunaka probe. Probe adalah untai DNA atau RNA yang bersesuaian dengan gen atau sekuen yang menjadi minat. Proses ini di kenal dengan penyatuan kembali (reanneling) atau hibridisasi. Untuk mengidentifikasi urutan sasaran probe harus membawa suatu label. Apabila probe membawa suatu label.

C.     CARA KERJA

Membuka situs NCBI

Isi kotak search nocleotide for dengan nama gen (kode gen)

Pilih gen dengan NM_000125.3 (pada latihan)

Dengan mengacu pada sekuen cDNA, membuat probe dengan mem-blok sekuen pada origin yang masuk dalam region CDS dengan mouse sepanjang (probe pendek), (probe sedang), (probe panjang)

Klik Run BLAST

Paste-kan rancangan probe pada kotak QUERY untuk mencari komplemennya job title isi nama pengguna

Pilih klik Human Genomic dan transcript pada menu database

Tekan BLAT

Dilakukan analisis apakah probe spesifik atau tidak dengan memperhatikan banyaknya kompetitor dan presentase komplemennya dibandingkan dengan gen target. Dan catat hasilnya

Dilakukan hal yang sama pada kode gen NM_000629.2 dengan rancangan probe (probe pendek), (probe sedang), (probe panjang)

Save semua data yang diperoleh.

D.    PEMBAHASAN

Praktikum ini bertujuan merancang dan menganalisis probe yang akan digunakan dalam Southern Blod dengan menggunakan Bioinformatics data base (NCBI). Serta untuk mengetahui dan memahami cara mendeteksi terjadinya ekspresi gen dengan teknik Hibridisasi metode Southern Blod.

Probe adalah untai tunggal yang dapat membentuk pasangan dengan urutan komplementer pada polinukleotida untai tunggal lain yang tersusun dari DNA atau RNA.

Merancang probe pada praktikum kali ini menggunakan tehnik hibridisasi Southern Blot. Teknik ini digunakan untuk pendeteksian suatu DNA sequence spesifik (gen atau lain) dalam sample kompleks DNA (selular DNA). Ini juga digunakan untuk menentukan bobot molekular suatu restriksi fragmen dan untuk mengukur sejumlah relatif dalam sample berbeda.

Merancang probe melalui situs NCBI yaitu http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ yang menyediakan gene bank database yang diperlukan untuk merancang suatu probe. Umumnya panjang probe 100-1000bp(base pair), panjang probe yang dirancang bervariasi tidak boleh kurang atau lebih dari yang ditentukan dengan mengacu pada region CDS. Region CDS adalah suatu region yang telah ditentukan yang berisi banyak basa yang berkomplemen dengan DNA yang menjadi target. Setiap kode gen yang berbeda maka mempunyai region CDS yang berbeda pula. Probe harus dirancang dalam region CDS karena probe dalam region CDS merupakan probe yang dapat mengekspresikan gen.

Pertama kali yang dilakukan pada percobaan ini yaitu menentukan reseptor e

Pertama kali yang dilakukan pada percobaan ini yaitu menentrukan reseptor estrogen 1 dengan kode gen NM_000125 dengan region CDS antara 806-4349. Percobaan ini dilakukan dengan memblok sebagian dari CDS sebagian probe. Ada 3 probe yang dibandingkan dengan range sebagai berikut :

1.      Probe 360 yang dianbil antara 241-600.

2.      Probe 509 yang diambil antara 241-750.

3.      Probe 1509 yang diambil antara 241-1750.